Questo è solo un breve riassunto di ogni argomento, definizione e dimostrazione presente nel file sottostante. Tutti gli argomenti trattati sono appunti delle lezioni di Biochimica (A.A. 2024/2025). Per la stesura di questi appunti è stato utilizzato anche il libro “I principi di biochimica di Lehninger di Nelson e Cox”.

1. Il dogma centrale della biologia molecolare e il flusso informativo

Il pilastro fondamentale su cui poggia l’intera biologia moderna è rappresentato dal suo dogma centrale, ovvero la sequenza unidirezionale DNA-RNA-Proteine. Possiamo identificare un gene come una porzione discreta di acido deossiribonucleico che custodisce le istruzioni biochimiche per la biosintesi di un elemento funzionale. Tale prodotto può manifestarsi sotto forma di una catena polipeptidica proteica oppure come una molecola di acido ribonucleico. Allo stato attuale delle conoscenze scientifiche la conservazione e la trasmissione dell’informazione genetica costituiscono le uniche funzioni biologiche attribuibili al DNA. Al contrario le molecole di RNA dimostrano una versatilità funzionale notevolmente superiore all’interno della cellula. Esistono infatti diverse tipologie di RNA e ognuna di esse ricopre un ruolo specifico e insostituibile nel metabolismo cellulare.

1.1 Specializzazione funzionale delle classi di RNA

Gli RNA ribosomiali, noti tecnicamente come rRNA, rappresentano i componenti strutturali primari dei ribosomi. Questi ultimi possono essere descritti come le officine macromolecolari deputate alla sintesi delle proteine. Gli RNA messaggeri o mRNA operano invece come intermediari dinamici nel flusso dell’informazione. Essi trasportano il codice genetico da uno o più geni bersaglio fino ai ribosomi citoplasmatici per la produzione delle proteine corrispondenti. Infine dobbiamo considerare gli RNA di trasferimento chiamati tRNA. Essi agiscono come molecole adattatrici con il compito di tradurre in modo estremamente fedele l’informazione contenuta nell’mRNA. Questa traduzione avviene convertendo la sequenza nucleotidica in una precisa successione di amminoacidi.

1.2 Dinamiche di trascrizione e traduzione nel comparto cellulare

L’informazione contenuta nella doppia elica deve necessariamente essere sottoposta a processi di trascrizione e successiva traduzione. Questo implica che l’informazione custodita nel DNA debba subire un processo di trascrizione regolata che avviene all’interno del nucleo cellulare. Tale fase porta alla sintesi delle diverse tipologie di RNA come i messaggeri e i trasportatori. In un secondo momento interviene il processo di traduzione in cui l’informazione derivata dall’RNA viene impiegata per la sintesi proteica effettiva. Questo passaggio operativo si svolge integralmente nel citoplasma e coinvolge attivamente i ribosomi.

2. Architettura strutturale e biochimica del DNA

La conformazione spaziale del DNA è quella di una doppia elica caratterizzata da due catene polinucleotidiche che risultano essere antiparallele. Tale configurazione geometrica determina la formazione di una scanalatura maggiore e di una scanalatura minore sulla superficie esterna della molecola. Da un punto di vista biochimico il DNA è costituito da una sequenza ordinata di nucleotidi. Ogni singolo nucleotide è formato da una base azotata unita a uno zucchero pentoso e a uno o più gruppi fosforici. I nucleotidi sono dunque i mattoni fondamentali che edificano gli acidi nucleici. La stabilità di questa struttura è vitale per la conservazione dell’informazione attraverso le generazioni. Ogni alterazione permanente che colpisce la struttura primaria del DNA viene definita mutazione.

2.1 Basi azotate e regole di complementarità

Le basi azotate sono posizionate verso l’interno della doppia elica e interagiscono in modo complementare. Esse vengono classificate in due grandi famiglie biochimiche chiamate purine e pirimidine. Sia nel DNA che nell’RNA troviamo quattro tipi differenti di basi azotate. Le purine sono identificate nell’adenina e nella guanina. Le pirimidine sono invece la citosina la timina e l’uracile. Una differenza fondamentale risiede nella presenza della timina nel DNA e dell’uracile nell’RNA. Le basi azotate seguono rigide leggi di affinità chimica. All’interno della molecola di DNA l’adenina si lega esclusivamente alla timina. Allo stesso modo la guanina si lega sempre alla citosina. Nel caso dell’RNA l’adenina stabilisce invece un legame con l’uracile.

2.2 Caratteristiche dello zucchero pentoso e legami glicosidici

Le basi azotate sono congiunte a un’unità glucidica rappresentata dal ribosio nell’RNA e dal deossiribosio nel DNA. La distinzione chimica tra i due zuccheri risiede nell’atomo di carbonio in posizione 2. Il deossiribosio presenta due atomi di idrogeno mentre il ribosio possiede un gruppo ossidrilico. Entrambi i pentosi adottano una forma ciclica chiamata beta-furanosica che consiste in un anello a cinque termini. Tale struttura non è planare ma può assumere conformazioni spaziali definite puckering. La base azotata si unisce al carbonio 1 dello zucchero mediante un legame glicosidico. Definiamo nucleoside una molecola composta da base e zucchero ma priva del gruppo fosforico. Se consideriamo l’adenina legata al ribosio otteniamo l’adenosina. L’aggiunta del fosfato trasforma l’adenosina nel nucleotide chiamato adenilato.

2.3 Orientamento dei legami fosfodiesterei e stabilità chimica

Nelle purine il legame glicosidico coinvolge l’azoto in posizione 9 mentre nelle pirimidine riguarda l’azoto in posizione 1. Il carbonio 5 dello zucchero si lega invece a un gruppo fosforico. La stabilità tra le basi complementari è garantita dalla formazione di legami a idrogeno. La coppia guanina-citosina risulta più stabile della coppia adenina-timina perché stabilisce tre legami idrogeno invece di due. I nucleotidi che compongono la catena sono uniti da un legame fosfodiestereo. Tale legame si stabilisce tra il gruppo ossidrilico del fosfato in 5′ e il gruppo ossidrilico in 3′ dello zucchero successivo. Lo scheletro degli acidi nucleici è un’alternanza di gruppi fosforici e residui di pentoso mentre le basi sono gruppi laterali. Questi scheletri sono idrofilici e presentano cariche negative a pH fisiologico.

3. Dinamiche molecolari della duplicazione del DNA

L’informazione genetica deve essere trasmessa con precisione assoluta alle cellule figlie durante la divisione cellulare. La cellula madre deve fornire l’intero corredo genetico alla progenie. Questo trasferimento avviene mediante il processo biochimico della duplicazione del DNA. Nel sistema umano la duplicazione è definita di tipo semi-conservativa. Ciò significa che ciascun filamento originale funge da stampo per la creazione di una nuova elica complementare. La doppia elica è mantenuta salda dai legami a idrogeno tra le basi azotate. Quando le catene si separano ognuna di esse diventa la matrice per la sintesi di una catena figlia speculare. Tale evento è integrato nel ciclo cellulare e avviene durante la fase S.

3.1 Polarità della sintesi e l’azione della DNA polimerasi

La sintesi di nuovo DNA può avvenire esclusivamente seguendo la direzione 5′-3′. L’enzima principale deputato a questa funzione è la DNA polimerasi. Questo enzima catalizza l’aggiunta di nuovi nucleotidi solo all’estremità 3′ del filamento in crescita. Tale vincolo biochimico impone dinamiche diverse per i due filamenti della doppia elica. Il filamento stampo che orienta in direzione 3′-5′ permette la creazione di un filamento veloce. Questo processo inizia con l’applicazione di un primer di RNA che funge da innesco. Successivamente i nucleotidi complementari vengono aggiunti in modo lineare e continuo.

3.2 Frammentazione del filamento lento e frammenti di Okazaki

Il filamento stampo con orientamento 5′-3′ presenta invece una sfida cinetica. La sintesi del suo complementare non può procedere in modo lineare ma deve avvenire in modo frammentato. In questo caso la DNA polimerasi opera in modo discontinuo producendo i cosiddetti frammenti di Okazaki. La cellula utilizza numerosi primer di RNA per avviare la sintesi di piccole sequenze complementari sempre in direzione 5′-3′. Questi segmenti separati vengono poi congiunti stabilmente dall’enzima DNA-ligasi. Il processo complessivo richiede l’intervento dell’enzima DNA-elicasi che ha il compito di srotolare la doppia elica originale.

4. Eziologia delle mutazioni e danni alla struttura genomica

Le radiazioni ultraviolette rappresentano una causa comune di alterazione del materiale genetico. Una delle mutazioni più frequenti causate dai raggi UV è la formazione dei dimeri di timina. In questo processo si genera un anello di ciclobutano che distorce la geometria del DNA. Tale danno strutturale può indurre mutazioni genetiche permanenti se non riparato. I dimeri di timina possono inoltre accelerare le mutazioni per transizione. Ad esempio la citosina può perdere il suo gruppo amminico trasformandosi spontaneamente in uracile. Sebbene questa reazione avvenga naturalmente i danni da UV ne aumentano drasticamente la frequenza. Ciò altera la coppia originale C-G trasformandola in una configurazione U-G.

4.1 Conseguenze della deaminazione e siti apurinici

Durante la successiva duplicazione l’elica contenente uracile farà da stampo per un filamento con adenina. Questo porta alla formazione di una molecola di DNA mutata di tipo U-A. Attraverso cicli successivi di replicazione si passerà dalla coppia citosina-guanina alla coppia timina-adenina. Un’altra tipologia di danno è la creazione del sito apurinico o sito AP. Questo evento deriva dall’idrolisi del legame glicosidico tra lo zucchero e una purina. La base azotata si distacca lasciando un vuoto nel filamento. Durante la replicazione questo vuoto impedisce l’appaiamento corretto. La cellula tende a inserire un’adenina in corrispondenza del sito vuoto creando una mutazione nella sequenza figlia.

4.2 Agenti alchilanti e alterazioni dell’appaiamento

Esistono inoltre agenti chimici alchilanti capaci di modificare le basi azotate. Un esempio tipico è la trasformazione della guanina in metilguanina. Tale base modificata non segue più le regole di appaiamento standard. La metilguanina tende infatti a legarsi alla timina invece che alla citosina. Fenomeni simili colpiscono la timina che quando viene metilata interagisce con la guanina invece che con l’adenina. La cellula possiede sofisticati sistemi di controllo per correggere questi errori. Tuttavia se le mutazioni superano la capacità di riparazione il rischio è lo sviluppo di patologie tumorali.

5. La metodologia della Polymerase Chain Reaction (PCR)

La tecnica della PCR è valsa il Premio Nobel a Kary Mullis per la sua portata rivoluzionaria. Questa metodica consente di amplificare in modo esponenziale sequenze specifiche di DNA. In termini pratici è possibile generare milioni di copie di un frammento genico partendo da un campione infinitesimale. La PCR rappresenta una replica controllata in vitro dei processi di duplicazione cellulare. La reazione si articola in cicli ripetuti composti da tre fasi termiche distinte. La prima fase è la denaturazione o DNA Melting che avviene a temperature superiori ai 90 gradi. In questa fase i legami idrogeno si rompono e le due eliche si separano completamente.

5.1 Fasi di annealing e allungamento nella PCR

La seconda fase è definita appaiamento dei primer o annealing. In questo stadio la temperatura viene abbassata intorno ai 55 gradi per permettere l’unione dei primer. I primer sono brevi sequenze di oligonucleotidi complementari ai tratti che delimitano la zona da amplificare. Esistono un primer forward e un primer reverse entrambi orientati in direzione 5′-3′. La terza fase è l’allungamento o elongation che avviene a 72 gradi. In questo momento l’enzima Taq polimerasi aggiunge i nucleotidi utilizzando i primer come punti di innesco. La ripetizione di questi cicli permette di ottenere quantità di DNA misurabili e analizzabili.

5.2 Reagenti e varianti biochimiche della tecnica

I componenti essenziali per una PCR includono il DNA stampo estratto dai tessuti e i primer specifici. Sono necessari inoltre i deossiribonucleotidi trifosfati ovvero dATP dTTP dGTP e dCTP. La miscela richiede un tampone specifico contenente cloruro di magnesio per l’attivazione enzimatica. L’enzima utilizzato è la Taq polimerasi derivata dal batterio termofilo Thermus aquaticus. Questo enzima è termostabile e non si degrada durante le fasi ad alta temperatura. È possibile amplificare anche molecole di RNA trasformandole preventivamente in cDNA. Questo avviene grazie all’enzima trascrittasi inversa che sintetizza DNA complementare partendo dall’RNA.

6. Monitoraggio e quantificazione del prodotto di amplificazione

Per misurare l’informazione ottenuta tramite PCR si utilizzano spesso sonde fluorescenti. Una metodica molto comune prevede l’impiego del colorante SYBR GREEN. Questa molecola emette fluorescenza solo quando si lega al DNA a doppio filamento. Durante la fase di denaturazione il segnale è assente perché le eliche sono separate. La fluorescenza inizia a manifestarsi durante l’annealing e raggiunge il massimo al termine dell’allungamento. Sebbene sia efficace il SYBR GREEN risulta poco specifico poiché si lega a qualunque doppia elica. Una soluzione più avanzata è rappresentata dalle sonde Taqman. Queste sonde sono specifiche per un singolo gene bersaglio e utilizzano un sistema fluoroforo-quencher.

6.1 Funzionamento delle sonde Taqman e segnale fluorescente

Inizialmente la sonda non emette alcun segnale luminoso a causa della vicinanza del quencher. La fluorescenza viene sprigionata solo quando il fluoroforo viene fisicamente separato. Questo accade grazie all’attività esonucleasica della Taq polimerasi durante la sintesi. Quando l’enzima incontra la sonda legata al gene la taglia liberando il fluoroforo nel mezzo. Una volta libero il fluoroforo può emettere luce poiché non è più inibito dal quencher. L’intensità del segnale rilevato è direttamente proporzionale al numero di cicli e alla quantità di DNA prodotta.

7. Funzioni bioenergetiche e regolatorie dei nucleotidi

I nucleotidi ricoprono ruoli fondamentali che vanno oltre la costituzione degli acidi nucleici. Essi operano come primari trasportatori di energia chimica all’interno dei sistemi viventi. L’esempio più celebre è l’adenosina trifosfato o ATP che possiede tre gruppi fosforici. I legami tra i gruppi fosfati β e γ sono di tipo fosfoanidridico e contengono molta energia. L’idrolisi di questi legami rilascia circa 30 kilojoule per mole di energia utile. Questa energia viene impiegata dalla cellula per alimentare trasporti attivi come la pompa sodio-potassio. L’ATP agisce inoltre come donatore di gruppi fosfato per la fosforilazione di molecole come il glucosio.

7.1 Ruolo dei cofattori e dei secondi messaggeri

I nucleotidi sono componenti essenziali di cofattori enzimatici come il NAD e il FAD. Questi composti partecipano attivamente alle reazioni di ossidoriduzione cellulare. Il NAD in forma ridotta trasporta elettroni verso i mitocondri per alimentare la catena respiratoria. Tale processo è indispensabile per la sintesi finale di ATP mediante l’enzima ATP sintasi. Infine i nucleotidi svolgono funzioni di messaggeri chimici nella trasduzione del segnale. L’AMP ciclico derivato dall’ATP funge da secondo messaggero intracellulare. Esso attiva la proteina chinasi A per innescare risposte cellulari specifiche. Deficit in queste vie di comunicazione causano patologie come il diabete di tipo 2. In questa condizione l’insulina non riesce a comunicare correttamente con i suoi recettori cellulari.

8. Sviluppo biotecnologico dei vaccini COVID-19

La ricerca scientifica ha prodotto diverse tipologie di vaccini basate sull’impiego degli acidi nucleici. Il vaccino sviluppato da AstraZeneca utilizza la tecnologia del vettore virale. Esso contiene una sequenza di DNA che codifica per la proteina spike del virus. Una volta introdotto nella cellula il DNA viene trascritto in RNA e poi tradotto in proteina. Questa produzione stimola il sistema immunitario a generare anticorpi specifici. Tale approccio permette una conservazione a temperature di refrigerazione standard.

8.1 Caratteristiche dei vaccini a mRNA e nanoparticelle lipidiche

I vaccini prodotti da Pfizer e Moderna si basano invece sull’impiego diretto di RNA messaggero. L’RNA viene incapsulato all’interno di nanoparticelle lipidiche protettive. Queste vescicole facilitano l’ingresso dell’acido nucleico attraverso la membrana cellulare fosfolipidica. Una volta nel citoplasma l’RNA viene immediatamente tradotto dai ribosomi dell’ospite. La sintesi della proteina spike avviene così in modo rapido senza la necessità di ingresso nel nucleo. Questo sistema garantisce un’induzione efficace della risposta immunitaria contro il patogeno virale.

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